Dependendo de como você edita a imagem ela pode perder número de cores - isso é bom - e isso faz com que os pixels transparentes sejam substituídos para reorganizar o arquivo. A extensão do arquivo também conta, por isso o RM requer que você use imagens em .png. Esse tileset fica normal por não ter fundo, o RM não precisa "descobrir" o que é transparente ou translúcido nela.
